女性上生殖道微生物试管大概多少钱群特征及其对生殖与辅助的影响？

作者：俞铎，巧姐，北京大学第三医院妇产科生殖医学中心，中国医学科学院鸡蛋成熟障碍综合诊疗创新单位 人体微生物群是指存在于人体内部和表面的全部微生物种群。据估计，人体内部和表面的细菌数量与构成人体的细胞总数具有相同的数量级[1-2]。随着人类基因组计划(HGP)的完成，“第二个人类基因组计划”的概念再次被提出。2007年，美国国立卫生研究院(NIH)启动了人类微生物项目(HMP)，该项目分析了包括女性阴道在内的正常健康志愿者不同部位的微生物特征[3]。 近10年来，对人体不同器官微生物群落的研究成为热点，人们对微生物群落在人体健康中作用的认识不断加深。微生物群落的失衡或失衡与疾病的发生有关。越来越多的证据表明，女性生殖道微生物群落的变化可能影响生殖健康。过去，更多的研究集中在阴道微生物群对生殖的影响[4-5]，而对女性上生殖道微生物群的研究很少，这些微生物群由定殖在子宫腔、输卵管和卵巢中的微生物组成。近年来，随着技术的发展，特别是基于测序的细菌检测方法的应用，关于上生殖道微生物区系的文献逐渐增多。试管多少钱？综述了上生殖道微生物区系的研究现状，阐述了上生殖道微生物区系的常用研究方法、上生殖道微生物区系的特点及其对生殖和辅助生殖的影响。 从已发表的文献来看，微生物群落研究主要采用两种技术，即培养法和非培养法，即基于培养的技术和基于测序的技术。 1.1培养技术在早期，对生殖道微生物区系的研究大多采用培养技术。将标本接种在不同的培养基上，生长一段时间后，根据革兰氏染色、细胞形态、细菌代谢产物和生化反应试验的特点进行细菌鉴定。但发现由于培养条件不满足或一个菌株对另一个菌株的抑制，大多数微生物生态系统中只有少量细菌能够在实验室繁殖，而培养成功是后续研究分析的前提条件，因此基于培养的技术会大大降低所研究微生物群落的多样性[6-7]。虽然基于培养的技术仍然是微生物群落研究的基本和有效的手段，但在解释和分析其数据时应考虑到这一局限性。

1.2基于测序的技术第一次细菌基因组测序于1995年完成[8]。从那时起，细菌DNA数据库发展迅速。今天的技术可以分析样本中数百万个细菌DNA序列。细菌DNA测序技术克服了培养方法的缺点，使得检测传统上难以或不可能培养的细菌成为可能，为微生物群落的研究带来了突破，其中16S rRNA基因测序是近年来应用最广泛的技术。试管多少钱 16S rRNA是原核生物核糖体30S亚基的一个组成部分，其对应的DNA序列为16S rRNA基因，长度约为1540 bp，是原核生物特有的，存在于所有细菌和古细菌的基因组中。16S rRNA基因测序技术的理论基础是它包含10个保守区和9个高变区(v1 ~ v9)，它们交替排列。保守区是缓慢进化区，可用于设计通用引物，高变区是快速进化区，其变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过对一个或多个高变区进行扩增和测序，可以在“属”甚至“种”的水平上对细菌进行鉴定，微生物组研究的主要流程包括样品采集和保存、DNA提取和纯化、目的片段的PCR扩增和测序、数据清洗和分析等。[10].与阴道菌群采样相比，上生殖道采样过程更为复杂，通常具有侵入性。子宫内膜菌群采样主要有三种方式，即经宫颈采样、腹腔镜或开腹手术中通过子宫小切口或穿刺针吸取样本[11]和直接从子宫切除术标本中采样子宫内膜[12]，其中经宫颈采样最适合人群，但应尽可能避免来自阴道或宫颈的污染。常用的方法有：人工授精(IUI)导管吸取子宫内膜液[13]，子宫内膜拭子[14]，用专用的子宫内膜采样器采样(如陶刷，在采样过程中刷入或刷出宫腔，有保护套避免宫颈或阴道污染)[15]或胚胎移植后直接使用导管顶部[16]。一些研究比较了通过子宫微切口获得的子宫内膜样品和在腹腔镜或开放手术中通过子宫颈获得的子宫内膜样品，发现它们之间的细菌分布高度相似。因此，对于非手术患者，通过宫颈取样分析子宫内膜菌群是可以接受的[11]。输卵管菌群的采样方法主要有腹腔镜或剖腹术中采样[11]和输卵管切除术后采样[12]，也有对盆腔炎的研究，其中输卵管切除术中积聚的输卵管积水或脓液被吸入进行菌群分析[17]。卵巢菌群的采样方法主要包括阑尾切除术后的采样[12]和取卵时卵泡液的提取[18]。 采集样品后，样品可在-80冷冻，然后进一步加工。目前试剂盒主要用于DNA提取。采样过程中除了避免阴道和宫颈分泌物、血液等污染外，作为低生物量样本，上生殖道微生物群样本在DNA提取过程中也会受到来自试剂盒和周围环境的细菌DNA的污染。因此，建议在上生殖道微生物群研究中设立阴性对照组和空白对照组[19]。16S rRNA基因的高变区(v1 ~ v9)有不同的通路 度的序列多样性，在对细菌进行区分时并非每个高变区都具有相同的特异性，因此PCR扩增片段的选择对研究结果有很大影响，目前在人类微生物群研究中较多使用的是V1～V2、V3～V5和V4高变区［20-22］。在完成基因扩增及产物纯化后，构建测序文库，进行基因测序，目前测序技术多采用高通量测序，即下一代测序（NGS），常用的测序平台有Roche 454、Illumina Miseq和Ion Torrent PGM。测序完成后进行生物信息统计分析，常用软件有mothur、Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）和Ribosomal Database Project classifier（RDP classifier）等，通常按照97%相似性阈值将所得序列聚类为不同操作分类单元（OTU）［23］，将OTU代表序列与已有的16S rRNA数据库比对（如Greengenes，Ribosomal Database Project等），得到每个样本所含的物种信息，继而对各样本及不同组间样本的微生物多样性等进行分析。 除16S rRNA基因测序外，宏基因组测序也是目前应用较多的方法。宏基因组测序是对样本中的全部微生物的总DNA进行测序。16S rRNA测序主要研究群落的物种组成及多样性等，而宏基因组测序在此基础上还可对基因功能、参与的代谢途径、微生物之间以及与宿主相互关系等进行分析。 长期以来，人们普遍认为在健康状态下包括宫腔、输卵管、卵巢等在内的女性上生殖道为无菌环境，细菌的存在只与病理状态相关，如阴道细菌上行导致感染和炎症等。随着分子生物学及测序技术的应用，越来越多的研究已证明健康女性的上生殖道中普遍有细菌定植。 2.1 子宫内膜微生物群的特征在现有的大部分研究中，乳杆菌是子宫内膜微生物群的优势菌属。Mitchell等［24］对58例行子宫切除术女性宫腔微生物群进行研究，用实时荧光定量PCR（qPCR）和广谱16S rRNA基因序列检测12种特定菌种，结果显示其中95%（55例）有至少1种细菌存在或16S PCR阳性，最常见的菌种为惰性乳杆菌、普雷沃菌和卷曲乳杆菌，而子宫内膜炎症标志物在所有样本间无差异。该研究首次通过分子生物学方法证实了宫腔内细菌定植。Franasiak等［16］将33例行单胚胎移植患者纳入研究，在胚胎移植后留取移植导管顶端5 mm部分作为样本进行16S rRNA测序，共检测出278个不同菌属，持续妊娠组（18例）和未持续妊娠组（15例）微生物群的最主要菌属均为黄杆菌和乳杆菌。Tao等［25］同样利用胚胎移植导管顶端样本测序对70例体外受精（IVF）患者胚胎移植时子宫内膜微生物群进行研究，结果发现在70个样本中均可检测到乳杆菌属，其中有33例乳杆菌丰度占90%以上，50例乳杆菌丰度占70%以上。此外，在较多样本中检测到的菌属还包括棒杆菌（40/70）、葡萄球菌（38/70）、链球菌（38/70）和双歧杆菌（15/70）。Moreno等［26］从健康育龄女性中获得子宫内膜液样本，通过16S rRNA测序鉴定出166个OTU，其中最具代表性的为乳杆菌属（71.7%），其次为加德纳菌属（12.6%）、双歧杆菌属（3.7%）、链球菌属（3.2%）和普雷沃菌属（0.866%），子宫内膜微生物群与阴道微生物群的构成不完全相同，证明子宫内膜微生物群存在且不是单纯的阴道微生物群移行的结果。 2.2 输卵管微生物群的特征由于取样困难，目前对于输卵管微生物群的研究相较子宫内膜微生物群的研究少，且更难将健康个体纳入研究。以往对于输卵管内微生物的描述主要局限于对性传播疾病病原体（如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和支原体等）或细菌性阴道病相关病原体的培养，随着基因测序技术的发展，已有研究证明在非炎症状态下输卵管也有细菌定植，并尝试对输卵管微生物群进行描述。 Walther-António等［27］对31例行全子宫双附件切除术患者的阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等微生物群进行研究，其中包括17例子宫内膜癌患者、4例子宫内膜增殖症患者和10例因妇科良性疾病而行手术的患者，结果显示：在输卵管微生物群中，志贺氏菌属和拟杆菌属是最主要的分类群，葡萄球菌、乳杆菌、巴恩斯氏菌和假单胞菌较常见于良性疾病组。Miles等［12］通过对10例行全子宫双附件切除术女性的阴道、子宫颈、子宫、输卵管和卵巢进行取样研究，发现子宫肌层、子宫内膜和输卵管的微生物群构成与阴道有显著差异；而且与阴道和子宫颈相比，卵巢、子宫内膜、子宫肌层和输卵管的微生物群在其各自的组成上更多样。Chen等［11］对95例育龄女性的生殖道微生物群进行研究，结果显示从阴道、宫颈到上生殖道，乳杆菌在微生物群中所占比例逐渐下降，在输卵管开口处乳杆菌属相对丰度的中位数降至1.69%；分析显示双侧输卵管微生物群基本相同，输卵管的标志性OTU包括假单胞菌属、丹毒丝菌属和费克蓝姆菌属，腹腔液中的标志性OTU有假单胞菌、摩根菌、鞘氨醇杆菌和漫游球菌，与阴道微生物群以乳杆菌为主不同，子宫颈管和子宫内膜中未发现标志性分类群，说明子宫颈管和子宫内膜可能是阴道与上生殖道微生物群的过渡区；qPCR检测各解剖部位的生物量显示上生殖道微生物群的生物量比阴道内（1010～1011）低4个数量级。Pelzer等［28］为研究输卵管微生物群对生殖健康的影响，对16例行输卵管切除术患者的输卵管微生物群进行分析，结果表明输卵管中细菌丰度较身体的其他部位低，并非所有样本中均有乳杆菌存在，且乳杆菌不是最优势菌属，主要的分类群包括葡萄球菌属、肠球菌属和乳杆菌属，其他丰度较高和典型的分类群还有假单胞菌、伯克霍尔德菌、丙酸杆菌和普雷沃菌；将样本根据不同标准进行分组进一步分析显示，输卵管壶腹部和峡部微生物群组成不同，左侧和右侧输卵管的群落分布也有显著差异，体现了微生物群的部位特异性差异；此外，绝经后女性输卵管较绝经前女性输卵管细菌多样性低，且有无曼月乐宫内节育器输卵管微生物群组成也存在明显差异，说明激素变化可能对定植的输卵管微生物群有影响。